Annexin V-FITCPI凋亡檢測試劑盒操作注意以下幾點
細胞凋亡是細胞的基本特征之一，在機體的胚胎發(fā)育、組織修復、內環(huán)境的穩(wěn)定等方面都起到十分重要的作用。Annexin V 是一種分子量為35.8 KD 的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與細胞凋亡過程中翻轉到膜外的磷脂酰絲氨-酸（Phosphatidylserine, PS）高親和力特異結合。FITC-Annexin V 結合到凋亡細胞后，在藍色光的激發(fā)下，發(fā)出綠色熒光，區(qū)分出凋亡細胞與正常細胞。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一種核酸染料，它不能穿透完整細胞膜，但對凋亡晚期細胞和死細胞的破損細胞膜能夠穿透，并使細胞核紅染。將FITC-Annexin V 與PI 匹配使用，可以將凋亡早期的細胞和晚期的細胞區(qū)分開來。
細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨-酸(PS)從細胞膜內轉移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。AnnexinV具有易于結合到磷脂類如PS的特性，對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。PS轉移到細胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此，可以采用AnnexinV與PI雙染的方法，通過流式檢測細胞早期凋亡。
注意事項：
1. 微量試劑需離?數秒將試劑收集?管底后再開蓋取?。
2. Propidium Iodide（PI）、Annexin V-FITC有毒，操作時要帶?套，使?時避免與?膚，眼睛和黏膜接觸。
3. 本試劑盒?于檢測活細胞，流式細胞儀檢測時，細胞數量不應低于1x106。
4. 染?后宜盡快檢測，時間過?可能會導致凋亡或壞死細胞的數量增加。
5. Annixin V檢測凋亡細胞的?法適?于懸浮??的細胞，如：淋巴細胞等細胞的檢測。對于貼壁??的細胞，由于在胰-酶等消化處理過程中會造成細胞膜的損傷，會造成較?的假陽性，而用細胞刮子會造成細胞粘連成團，從而影響檢測，可將胰-酶消化后的細胞保存在含2%BSA的PBS中，防?進?步的損傷。盡管?前，包括國外也有?些單位采?該?法檢測貼壁??的細胞。但不推薦，因為其重復性較差，且需要操作時?常??。
6. .細胞固定后可能導致熒光的淬滅，請不要固定樣品。
7. .如果樣品來源于血液，請務必除去血液中的血小板。因為血小板含有PS，能與Annexin V結合，從而干擾實驗結果。可以使用含有EDTA的緩沖劑并在200g離心洗去血小板。
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